Home » Cadeia do Leite » Identificação de microorganismos encontrados nos biofilmes em tanques de resfriamento no município de São Lourenço/MG

Identificação de microorganismos encontrados nos biofilmes em tanques de resfriamento no município de São Lourenço/MG

15/05/2018 11:12:09 - Por: Amanda Ribeiro de Souza Andrade, Luan Gavião Prado, Nydianne d’Angelis Rodrigues, Monytchely Vieira Lima, Gabriel Fernandes Silva, Leonardo José Rennó Siqueira em Revista V&Z

Baixas condições de higiene durante a obtenção e a manutenção do leite pode resultar em fonte de contaminação microbiológica e deterioração para os seus derivados.

Responsive image
A economia brasileira nos últimos anos tem se baseado no agronegócio e a produção leiteira é um dos alicerces que sustentam esse ramo. Em 2005, pela segunda vez, esse mesmo produto do qual o Brasil é tradicionalmente importador, fechou o ano com um saldo comercial positivo. A partir daí, a expectativa entre os produtores em relação ao leite aumentou, fazendo com que os investimentos nessa área crescessem (IZIDORO, 2008).

Entende-se por leite, sem outra especificação, o produto oriundo da ordenha completa, ininterrupta em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas. O leite de outros animais deve denominar-se segundo a espécie de que proceda (RIISPOA, 1952).

Ao mesmo tempo que o leite é um alimento de origem animal que apresenta um extraordinário valor nutritivo para o consumo humano, ele também constitui um excepcional meio de cultura para a multiplicação de microrganismos, podendo ser eles, patogênicos ou deteriorantes (CAVALCANTI, 2010).

Visando melhorias na produção leiteira, em 2002, foi criada a primeira Normativa pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, que estabeleceu a implantação do transporte refrigerado do leite cru e de sua refrigeração pós-coleta, por meio dos tanques de resfriamento do tipo expansão nas propriedades (MARTINS, 2004).

Inúmeros aspectos estão relacionados a fonte de contaminação do leite, como, o exterior do úbere e tetos, a superfície dos equipamentos utilizados, utensílios no momento da ordenha, aspectos relacionados com o ordenhador, além da conservação do leite em tanques de expansão e o seu transporte (MESQUITA et al., 2002).

Para que o foco de melhoria seja atingido, a refrigeração do leite durante o processo de seu manuseio não é suficiente. É necessário que haja uma adequada higienização dos tanques de resfriamento onde o leite será armazenado, para que ocorra a diminuição das multiplicações de bactérias resultando assim em um leite de melhor qualidade (FAGUNDES et al., 2004).

A higienização tem como o principal objetivo a preservação da qualidade microbiológica dos alimentos, auxiliando e garantindo a obtenção de um produto com boas qualidades nutricionais, sensoriais e com condição higiênica que não ofereça risco a saúde do consumidor (CAIXETA, 2008).

Falhas em processos de higienização permite que sobras de resíduos orgânicos fiquem aderidos nas superfícies de equipamentos, dificultando o processo de limpeza e de remoção, se tornando uma grande fonte de contaminação. A partir dessas aderências, o crescimento celular se inicia e os microrganismos contidos nele vão se multiplicar, formando uma massa celular, que vai agregar outros micro-organismos, resíduos e nutrientes, dando origem ao biofilme (OLIVEIRA, 2010).

O biofilme é caracterizado pela adesão de micro-organismos a suportes sólidos, provocando alterações fenotípicas das células que são descritas como estratégias dos microrganismos para sobrevivência em ambientes com condições adversas (OLIVEIRA, 2010). É considerado um biofilme, o número de células aderidas entre 106 e 107 UFC / cm2 (PARIZZI, 1998).

Devido ao seu fortalecimento, micro-organismos presentes no biofilme podem sobreviver mesmo após o processo de sanitização, fazendo com que a adesão se torne mais resistentes e posteriormente sejam desprendidas, podendo contaminar outras superfícies e os produtos alimentícios, resultando em problema de saúde pública e degradação dos produtos (SANTOS, 2009).

Vários tipos de micro-organismos podem contribuir para a formação dos biofilmes. Nas indústrias de alimentos, duas principais classificações de bactérias são conhecidas, sendo elas, mesófilas e psicrotrópicas (ANDRADE, 2003).

Bactérias psicrotróficas são aquelas que apresentam altas taxas de multiplicação em condições de resfriamento, onde a temperatura ideal foi definida abaixo de 7ºC. Essas são as responsáveis principais pela deterioração do leite cru refrigerado e dos seus produtos (FRANCO, 1996).

Demonstram comportamento psicrotrófico tanto bactérias Gram-negativas, como Pseudomonas, Achromobacter, Artomonas, Serratia, Alcaligenes, Chromobacterium e Flavobacterium spp, quanto bactérias Gram-positivas, como Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Streptococcus, Lactobacillus e Micobacterium (BASTOS, 2017).

As mesófilas são as principais bactérias indicativas de qualidade da obtenção e do processamento dos alimentos. Uma alta taxa de contagem desses microrganismos demonstra procedimentos inadequados na produção ou na conservação do leite cru (FRANCO, 1996).

As bactérias mesófilas são definidas como aquelas que tem a capacidade de se desenvolver em temperaturas ambientes, em torno de 20ºC a 45ºC, sendo a temperatura ideal 32ºC (MAIESKI, 2011). Esse grupo de bactérias inclui a maioria dos contaminantes do leite, tanto deteriorantes quanto patogênicos, além de incluir os principais agentes acidificantes (JAY, 2005).

Segundo Siqueira (2012) as bactérias encontradas com mais frequência no leite são Streptococcus spp. e Staphylococcus spp., sendo que esses agentes são os principais causadores da mastite bovina e contribuem também para elevar o número de micro-organismos mesófilos do leite.

Realizando-se uma adequada e eficiente higienização, a contaminação alimentícia é evitada, além de auxiliar e garantir a obtenção de um produto com boas qualidades nutricionais, sensoriais e com condição higiênica que não ofereça risco a saúde do consumidor (CAIXETA, 2008).

O presente trabalho teve como objetivo verificar se há relação entre as bactérias identificadas nos biofilmes presentes na superfície dos tanques de resfriamento de tipo expansão com as bactérias identificadas pelo cultivo do leite armazenado nestes tanques, sendo possível assim, averiguar se há influência de contaminação do recipiente de conservação para o produto nele ocupado.

Material e Métodos

O presente trabalho foi realizado no período de agosto a outubro de 2016, em sete propriedades do município de São Lourenço, Minas Gerais. Foram coletadas amostras de cinco pontos diferentes de cada tanque de resfriamento, após a higienização.

A colheita das amostras para identificação do biofilme foi realizada utilizando swabs estéreis umedecidos com água peptonada 0,1% estéril, por meio de fricção, aproximadamente com dez movimentos, feitos de intensidade de força moderada na superfície interna, em vários locais (cinco pontos de coleta), após a higienização, em uma área delimitada por um gabarito com 1cm2, devidamente esterilizado. Os swabs foram introduzidos em tubos de ensaio contendo 18 mL de água peptonada a 0,1% estéril.

Logo após a colheita, estes tubos de ensaio foram armazenados em caixas isotérmicas sob refrigeração (2ºC a 8ºC) e levadas para o Laboratório de Microbiologia da Fundação de Ensino e Pesquisa de Itajubá – FEPI.

Para a identificação de biofilme realizou-se a técnica de espalhamento em superfície, onde 0,1 mL das diluições foi inoculado em placas de Petri contendo Ágar Plate Count Ágar (PCA) e, com auxílio de alça de Drigalsky, semeadas na superfície do Ágar. Após incubação a 35ºC por 48 horas foi realizada a contagem das UFC (Unidades Formadoras de Colônias). Para ser considerado um biofilme, o número de células aderidas deve estar entre 106 e 107 UFC/ cm2 (PARIZZI, 1998).

Após o crescimento bacteriano, foram feitas lâminas e coloração pelo Método de Gram. Posteriormente, foi utilizado o Enterokit B® (PROBAC do Brasil) para identificação de enterobacteriaceas. A interpretação dos resultados foi realizada de acordo com indicações do fabricante.

Amostras de leite para identificação dos micro-organismos foi realizada diretamente do tanque de resfriamento, momentos antes da coleta do leite pelo caminhão isotérmico, por meio de conchas esterilizadas de aço inox. Foram coletadas 100 mL de leite em tubos estéreis.

Foram semeados 100?L de leite de cada amostra, em placas de Ágar Sangue de bovino a 10% e incubadas a 35ºC por 48 horas. Após o crescimento as colônias foram repicadas em novo Ágar Sangue de bovino a 10% para o isolamento e identificação dos micro-organismos encontrados. Todo processo foi realizado dentro da câmara de fluxo laminar, próximo ao bico de Bunsen, conforme recomendações de Siqueira (2012). Foram preparadas lâminas e a coloração pelo método de Gram. As bactérias Gram-negativas foram identificadas com o uso do Enterokit B® e a interpretação dos resultados realizado de acordo com as indicações do fabricante. Não foram trabalhadas as bactérias Gram-positivas detectadas nas amostras de leite coletadas destas propriedades.

Resultados e Discussão

Em todas as amostras coletadas houve crescimento de biofilme bacteriano. Com a utilização do Enterokit B® foram identificadas, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Serratia liquefaciens/Serratia marcescens, Salmonella spp., nas amostras coletadas (Tab.1).
Figura 01: Distribuição dos tipos de bactérias encontradas nas superfícies de tanques de resfriamento dos biofilmes bacterianos em sete propriedades rurais do município de São Lourenço, Minas Gerais (2016).

Foi observado que 57,16% das amostras apresentaram Proteus mirabilis, 14,28% Citrobacter freundii, 14,28% Serratia liquefaciens/Serratia marcescens e 14,28% Salmonella spp (Fig. 1).

A presença do biofilme bacteriano pode ser consequência de processos de higienização inadequados dos tanques de resfriamento (MACEDO, 2000). Sendo assim, o acúmulo de matéria orgânica vai ocorrer, permitindo a adesão de bactérias que se fortificam e se multiplicam, contaminando superfícies e produtos alimentícios armazenados nelas (SANTOS, 2009).

Produtos derivados de origem animal, como o leite, se destacam quando se trata de formação de biofilmes, fazendo a liberação de resíduos proteicos (RAVISHANKAR, 2010).

Para que evitar a formação de biofilmes bacterianos é necessário um procedimento correto de limpeza e sanitização das superfícies dos tanques de resfriamento. Pinto (2000) e Oliveira (2002), descrevem que um procedimento correto deve ser iniciado com água de alta pressão, seguido de utilização de agentes químicos e por último a administração de sanificantes.

Segundo Andrade (2003), entre as bactérias mais identificadas em biofilmes bacterianos, destacam-se Salmonella spp. e Escherichia coli, resultado que corrobora com o encontrado em duas propriedades deste estudo, bactérias essas consideradas deteriorantes e patogênicas.

Segundo os resultados de Souza (2005), 61,1% de amostras de leite cru apresentaram Proteus spp., sendo sugestivo que as vacas do rebanho apresentavam mastite, neste estudo houve resultado similar, onde 57,16% das propriedades foram positivas para a presença dessa bactéria. Por outro lado, os resultados divergem dos encontrados por Oliveira (2010), que identificou um índice consideravelmente inferior, com apenas 1,8% de Proteus spp., em amostras de leite cru retirados de latões.

Tabela 01: Bactérias identificadas nas amostras de biofilmes e leites resfriados coletados em tanques de resfriamento de sete propriedades rurais do município de São Lourenço, Minas Gerais (2016).
Ambos resultados demonstrados anteriormente foram compatíveis com o estudo realizado na Coréia do Sul, por IN (1995), onde 23,0% das amostras do leite cru utilizados na fabricação de produtos lácteos apresentaram Proteus spp. Generoso e Langoni (2011), ainda realizaram estudos com amostras de leite em tanque de expansão e concluíram que 3,48% eram de P. mirabilis.

As amostras foram coletadas diretamente de tanques de expansão, caracterizando a presença das mesmas em biofilmes. Nenhum dos trabalhos consultados apresentam dados em relação à presença destas bactérias em biofilme e/ou em tanques de expansão.

Sendo assim, a presença de P. mirabilis, como das outras bactérias identificadas em amostras de biofilmes coletadas em tanque de expansão pode causar prejuízos na produção de produtos de origem animal, assim como podem causar intoxicação alimentar em consumidores, diminuição de vida útil do produto na prateleira de produtos lácteos, além de acarretar o acúmulo do biofilme na superfície dos equipamentos e contaminação do próprio leite armazenado nesse tanque.

A presença das demais bactérias encontradas nas outras amostras de leite não correspondem com os resultados encontrados por Siqueira (2012), que detectou como as principais bactérias encontradas no leite a presença de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.

Conclusão

Segundo os dados obtidos das amostras, alguns tipos de bactérias encontradas nos biofilmes bacterianos foram compatíveis com os tipos de bactérias encontradas nas amostras de leite, indicando que há contaminação bacteriana da superfície do tanque de expansão para o leite nele armazenado.

As bactérias que não foram compatíveis com as encontradas nas amostras de leite indicam que apesar da não compatibilidade, há deficiência na higienização dos procedimentos em que o leite passa até chegar ao seu destino final, seja ele, no momento da ordenha, nas tubulações onde o leite passa, nas ordenhadeiras ou até mesmo no próprio tanque de resfriamento.

Bactérias patogênicas e deteriorantes presentes no leite podem trazer graves prejuízos, seja para o produtor ou seja para o consumidor. A ação e as enzimas das mesmas podem trazer problemas de saúde para quem consumir os determinados produtos, sendo que, esses produtos vão ter sua vida útil diminuída, além de não oferecerem sabor e aroma agradáveis.

Referências Bibliográficas

ANDRADE, N.J.; SILVA R.M.M.; BRABES K.C.S. Avaliação das condições microbiológicas em unidades de alimentação e nutrição. Ciênc. Agrotec., Lavras. V.27, n.3, p. 590- 596, maio/junho, 2003.

BASTOS, P.B. et al. Contagem de bactérias psicrotróficas e diferenciação comparativa pós-termização em leites pasteurizados. Encontro Nacional de Educação, Ciência e Tecnologia /UEPB. Universidade Estadual da Paraíba/Núcleo de Pesquisa e Extensão em Alimentos, 2017.

CAIXETA, D.S. Sanificantes químicos no controle de biofilmes formados por duas espécies de Pseudomonas em superfície de aço inoxidável. 2008. 75p. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2008.

CAVALCANTI, E.R.C. et al. Avaliação microbiológica em ordenhadeira mecânica antes e após adoção de procedimentos orientado de higienização. R. Bras. Cien. Vet., v. 17, n. 1, p. 3-6, jan./abr. 2010.

FAGUNDES, M. C.; FISCHEN, V.; DA SILVA, W. P.; CARBONERA, N.; ARAÚJO, M. R. Presença de Pseudomonas spp em função de diferentes etapas da ordenha com distintos manejos higiênicos e no leite refrigerado. Anais do XXI Congresso Nacional de Laticínios. Juiz de Fora, p.290-293, 2004.

FRANCO, B.D.G.M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo: Atheneu, 1996. 182p.

GENEROSO, D.; LANGONI, H. Avaliação da presença de Salmonella sp. na criação de bovinos de leite. Veterinária e Zootecnia, Botucatu, v.18, n.4, 2011.

* Para acesso às referências bibliográficas completas, entre em contato com os autores.

Autores:

Amanda Ribeiro de Souza Andrade: Médica Veterinária, CRMV-MG 17551. E-mail amanda.rsandrade@hotmail.com.

Luan Gavião Prado: Médico Veterinário, CRMV-MG 12271, Professor do Curso de Medicina Veterinária do Centro Universitário de Itajubá – FEPI.

Nydianne d’Angelis Rodrigues: Médica Veterinária, CRMV-MG 17224, Residente de Clínica Médica e Cirurgia de Pequenos Animais na Faculdade Federal de Viçosa.

Monytchely Vieira Lima: Médica Veterinária, CRMV-MG 17493.

Gabriel Fernandes Silva: Médico Veterinário, CRMV-MG 17386.

Leonardo José Rennó Siqueira: Médico Veterinário, CRMV-MG 5902, Coordenador e professor do Curso de Medicina Veterinária do Centro Universitário de Itajubá – FEPI.